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质谱沙龙2012年报告交流会报道
2013年6月18日 来源:分析测试百科 责编:李华静

2012年12月23日质谱沙龙2012年报告交流会即第三十七期质谱沙龙活动在首都医科大学附属北京朝阳医院报告厅如期举行。来自北京朝阳医院、北京大学人民医院、空军总医院、北医三院、北京安贞医院、北京大学、北京师范大学、军事医学科学院、AB SCIEX公司、北京艾米诺医学研究有限公司、北京伯奥克生物技术有限公司等百余名专家、学者、技术工程师参加了本次沙龙活动。本次沙龙围绕代谢组学、标准化方案、生物功能分析、ICP-MS和LC-MS/MS在医学临床的应用等方面展开讨论,会场气氛热烈,与会者畅所欲言,受益匪浅。


质谱沙龙2012年报告交流会现场


北京朝阳医院药事部 刘丽宏主任

北京朝阳医院药事部刘丽宏主任致辞,总结了质谱沙龙5年来的发展历程。2007年9月,由AB公司的李丹博士院和二炮医院的李鹏飞老师发起,北京朝阳医院和AB SCIEX公司主办,二炮总医院、北京师范大学质谱中心、北京艾米诺医学研究有限公司和分析测试百科网共同协办的质谱沙龙活动成功举办。“质谱沙龙”活动旨在为质谱使用和维护的一线人员提供交流平台,促进LC-MS/MS检测技术在医药、食品、环境、质检等科研领域中的应用。5年来“无偿公益”性质的质谱沙龙规模不断扩大,多家医院、高校、科研单位、国家机关、仪器公司积极参与进来,至今为止,质谱沙龙已经成功举办36期,已做了120余篇专题报告,内容涉及大分子蛋白、小分子化合物、重要单体/组方;应用方向涉及药物研发、临床药代、食品安全、中毒检测、临床诊断等;仪器技术包含仪器的操作、维护和保养、新技术新方法、新仪器和试剂等;通过这个平台也为大家介绍了很多本领域的实验室、目前热点的技术。质谱沙龙组织形式注重学术交流、经验技术的心得分享,因此每个报告后大家都可以自由提问,互相释疑。刘主任带领大家回顾了其中一些精彩报告和沙龙户外活动,它们都给大家留下了美好记忆。

随后刘主任介绍了几家主办单位和协办单位的情况。北京朝阳医院药事部在药物分析方面的工作主要是药代动力学,研究性工作有全谱氨基酸检测,激素维生素检测,新生儿筛查,免疫抑制剂FK506的质谱学研究,基因组和药代之间关系研究。AB SCIEX公司质谱仪器被很多实验室使用, AB SCIEX公司创新理念已产生了很多突破性的技术,为世界提供最具创新的,最高性能的质谱平台和解决方案,致力于改善人类健康和地球环境。二炮总医院药学部正在从事药代一期方面的研究。北京师范大学质谱中心拥有13台大型质谱仪器,涉及蛋白质分析、药物分析和资源环境分析。北京艾米诺医学研究有限公司专门致力于医学检测和新药开发领域。

李鹏飞老师曾经说过“质谱沙龙从婴幼儿成长起来,还有很多不足。有待大家共同努力和参与去培养她,希望能成为更具影响力和前瞻性的平台。”质谱沙龙未来的规划就是要把质谱沙龙构建成更自由、更活跃、更高层次的交流平台,可以做小分子定量质谱实验室多中心室间质评,有更广泛的网络交流。

北京大学分析测试中心高级工程师 周江博士

北京大学分析测试中心高级工程师周江博士报告题目是《小分子与G-四链体的相互作用与生物学功能研究》。

在很多癌症基因,疾病基因中都有G-四链体结构,因此目前G-四链体的研究比较热门。一方面它可以和小分子选择性结合,因此可以把它作为一个靶点,选择一些前药分子。另一方面它和蛋白、生物分子也有一些相互作用,就会涉及到转录、表达、细胞凋亡方面的关系。另外在疾病标志物方面涉及到标志物,就有可能进行一些疾病的诊断和治疗。周老师从G-四链体的生物学功能、结构和分布出发研究了小分子对G-四链体的调控,以及致病基因中G-四链体的结构。

周老师在研究G-四链体DNA的形成,不同结构间的平衡和筛选具有选择性的识别分子时选择了ESI源的质谱,这是一个快速有效的方法。随后使用核磁、荧光、电泳等方法验证ESI-MS的结果,确定DNA的构想、稳定性、结合模式和位点等。周老师研究了HIV-1整合酶抑制剂G-四链体的小分子,G-四链体及其非共价复合物的热稳定性,Bcl-2与G-四链体间平衡的移动,小分子对双链与G-四链体间平衡的影响,G-四链体的调控靶点,并筛选、设计了与G-四链体结合的大环分子,得到很多有意义的数据。

中国医学科学院药物研究所 陈艳华博士

中国医学科学院药物研究所陈艳华博士报告题目是《基于LC-MS/MS的恶性肿瘤代谢组学及药物代谢组学研究》。

代谢组学是关于生物体内源性代谢物质的整体及其变化规律的科学,广泛应用于疾病生物标志物的寻找和发现,进而有利于发现新的药物作用靶点。当代谢组学以药物的代谢规律及药物对内源性代谢物的影响为研究对象时,就诞生了药物代谢组学这一分支学科。Nicholson等于2006年在Nature上提出了“药物代谢组学”的概念,首次证明了给药前的代谢物表型能够预测药物给药后的代谢、药效和毒性差异。代谢组学的主要分析方法有核磁共振法和质谱法。它们各有优缺点。目前代谢组学研究的步骤是样品收集保存→检测数据分析→结构鉴定→生物学阐述→临床验证与应用。

样品收集和保存方面,陈老师主要考察了血浆的长期稳定性和血浆中代谢物短期稳定性。发现全血处理成血浆样品时间不能太长,全血要在4℃,1个小时内处理成血浆,处理好的血浆要在4℃,4个小时内检测,否则磷酸胆碱、烷胺类物质会发生很大的变化。

生物样品代谢物结构复杂,要建立一个全面完整代谢物信息的LCMS方法,首先要克服质谱的离子化歧视效应,尽可能使不同类型及极性的代谢物实现离子化,并可检测到体液中更多的内源性小分子代谢物。由于各离子化方法针对代谢物的适用范围不同,单一离子化方式的LCMS方法很难获取全面的代谢物信息。陈老师课题组在“减少分离,分类分析”研究思路的指导下,探索出适合复杂生物样本的“组合式”离子化方式的LCMS分析方法,最大限度的满足全面分析代谢物的需求,在实际样本的研究中获得共有或特有的可能生物标志物。

数据处理时采用代谢相关性网络分析和模式识别方法相结合,对代谢物进行动态行为分析,获得可能生物标志物信息。经过靶向代谢轮廓分析,验证已经找到的可能标志物。目前已经针对含量低、具有重要生物学意义的雌激素类代谢物建立了同时快速定量的靶向分析方法。代谢组学获得的研究成果将在药物疗效预测中发挥重大的作用。患者和健康人之间代谢组学研究可以找到潜在的标志物用于临床疾病的诊断、监测。

北京朝阳医院药事部主管药师 李鹏飞老师

北京朝阳医院药事部主管药师李鹏飞老师报告题目是《液质定量技术在医院药学中的应用、液质方法室间标准化方案探讨》

第一部分 质谱定量技术在医院药学中的应用

李鹏飞老师简单介绍了质谱仪的定义、特点、分类和应用。质谱仪是用来测量单个分子质量的仪器,提供分子的质量与电荷比。质谱包括进样系统、离子源、质量分析器、检测系统和显示记录五大部分。质谱法是一项强有力的分析技术,可用于未知化合物的鉴定、定量分析,分子结构及化学特性的确定等方面。所需化合物的量非常低,灵敏度高,分析速度快。质谱仪器可以分成静态仪器和动态仪器两大类,目前的质谱仪器多是多级技术质谱(如3Q、TOF-TOF等)、杂交质谱(如Q-TOF、Q-TRAP等)、联用质谱(如GC/LC/CE/UPLC/NANO-MS)、以及引入离子淌度、DART、LASE等其他技术的质谱。质谱仪器应用范围广泛,可以分为有机质谱和无机质谱。有机质谱类主要应用于生物、医药、聚合物、法医和环境等方面;无机质谱类主要应用于地球化学、地质矿产和无机元素分析鉴定等方面。

SDI数据显示我国进口质谱仪数量上升很快。2003年进口300多台,2007年达到1700台,2011年达到2600台。药害事件和乳制品事件发生之后,中国对质谱仪器需求急剧增加。国内专家估计,今后五年中国质谱市场年增长率会达到25%-30%。网络检索临床和质谱关键词,也可以搜索到很多篇相关文章。由此可以看出质谱在医院中的应用越来越广泛。目前主要应用领域有新药临床研究、诊断与医疗、基础科研。新药临床研究包括I期药代动力学、0期探索研究、II或III期的中心检测、药效或毒代。诊断与医疗包括新生儿遗传代谢病、未知毒物筛查、维生素激素类检测、治疗药物监测、微生物菌种鉴定、测序。基础科研包括蛋白质组学、代谢组学、成像技术、新药的筛选与发现等。在以上众多领域,质谱仪器以其专属性强、灵敏度和准确度高、重现性好等优点,提供了更精准的结果,使患者得到及时准确的治疗,节省了时间和费用,获得了很大的社会效益和经济效益。

第二部分 液质技术在医院中的初步应用

李鹏飞老师从4个方面举例说明了液质技术在医院的初步应用:I期新药临床研究、治疗药物监测及试剂盒开发、药物中毒快速筛查、内源性小分子定量检测。

I期新药临床研究已经完成40多项新药I期项目,发表核心期刊文章29篇,SCI文章3篇。李老师列举了帕诺洛司琼、奈必洛尔、氯吡格雷、雷奈酸的质谱检测方法和谱图。以他克莫司和环孢素的LC-MS/MS数据为例说明了液质联用技术在治疗药物监测中的应用。使用液质联用技术统计出中毒各年度的发生情况,中毒病例患者基本情况和检出的药物情况。3月,5-7月,11-12月为中毒事件高发期,女性自杀中毒比例更大,20-30岁间,41-55岁更易发生中毒或自杀。检出的中毒药物累计有277个,计91种,根据这些情况,应加强艾司唑仑、地西泮,咖啡因和替马西泮,阿普唑仑、劳拉西泮等药品的管理和流通,防止用药过量和自杀性用药。在内源性小分子定量检测中进行了全谱氨基酸检测,脂类、激素、新筛检测,并发表了多篇论文。因此液质技术在医院中的应用是多方面的,可以展开多元化的检测。

第三部分 液质方法室间标准化方案探讨

为了进一步保证实验室数据的准确性,实验室间经常会参加卫生部室间质评,计量认证和实验室认可,FDA和EMA的方法确认等。结合目前液质定量实验室无室间质评现状,李鹏飞老师初步探索了液质定量实验室测试结果的室间影响因素,提出要进行多中心盲法测试模式,第三方配制测试样本,5个品种均5个浓度水平,第三方评价的方案。

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AB SCIEX公司中国区资深市场开发专员 李春波老师

来自AB SCIEX公司中国区资深市场开发专员李春波博士为大家带来了题为《质谱研发的新动向》的精彩报告。

李博士首先介绍说:我们可以把质谱当成一个“天平”。质谱仪主要的发展方向包括高通量、高灵敏度、高分辨率、小型化、便携式五个方面,并以AB SCIEX公司质谱仪灵敏度的发展历史为例介绍了质谱发展的历史。

随后,李博士分别介绍了质谱仪主要的核心部件质谱离子源、质量分析器、检测器的相关信息。质谱仪器的研发也主要是针对这些核心部件来开发。

离子源

复杂基质样品进行快速质谱分析,目前商品化的离子源包括进样附件有DART离子源、ASAP通体分析探针。此外,除了去改进离子源外,AB SCIEX公司在液相方面也有改进,例如:微升的流速。微LC低流量LC / MS的改进方案,使得分离效率更高。同时在离子源里的探针,使微升级的流速过来的样品分析的灵敏度可以提高十倍到一百倍。AB SCIEX公司通过改进结构来提高质谱的灵敏度。

质量分析器

对厂家来说质量分析器是一个比较大的挑战,目前在这方面还没有较大的突破。在质量分析器方面,国内科学家对国产的仪器也做了很大的努力,我国掌握小型质谱仪研制的关键技术,但在精密度、分辨率方面与国外相比还有一些差距。

检测器

检测器分为电子倍增器和光电倍增器。对主流的厂家来说主要是应用电子倍增器。

其它方面的进展

目前,硬件无法提高的条件下,主要着手于开发应用于提高分析灵敏度的试剂及提高数据利用效率的软件。

最后,李博士介绍了AB SCIEX公司的移动实验室的相关内容。AB SCIEX移动实验室经历20000公里的旅程。4500串联四极杆和QTRAPr4500作为质谱分析的主力军,旅行城市35个,旅行时间77天,开(关)机次数40次,但是维修服务时间是0次,充分说明AB公司仪器具有很高的耐用性。

北京大学人民医院药剂科副主任药师 赵立波博士

来自北京大学人民医院药剂科的赵立波博士为大家带来了《Qtrap用于代谢组学的初步探索及其在糖尿病代谢组学中应用》的报告。

赵老师首先向大家介绍了代谢组学的相关概念。代谢组是一个细胞、组织或器官中,所有代谢组分的集合,尤其指小分子物质,而代谢组学则是一门“在新陈代谢的动态进程中,系统研究代谢产物的变化规律,揭示机体生命活动代谢本质”的科学。它所关注的是相对分子质量为1000以下的小分子。代谢组指的是“基因组学、转录组学、蛋白质组学,代谢组学统称为系统生物学。基因与蛋白质的表达紧密相连,代谢物则更多地反映了细胞所处的环境。对比几个基本概念,正如,Billy David所言:“基因组学和蛋白质组学告诉你可能发生什么,而代谢组学则告诉你已经发生了什么。”

接下来赵老师介绍了各组学的研究内容及其不足之处:如基因组学主要研究生物系统的基因结构组成,即DNA的序列及表达;转录组学则重点关注基因组在蛋白质转录过程中转录因子及与之相关的因素的变化和差异;蛋白质组学研究由生物系统表达的蛋白及由外部刺激引起的蛋白物质的差异。基因组学、转录组学、蛋白质组学自身存在不足,其中基因组的变化不一定能够得到表达,因而并不对系统产生影响;某些蛋白的浓度会由于外部条件的变化而升高,但由于这个蛋白可能不具备活性,因而也不对系统产生影响。另外,由于基因或蛋白的功能补偿作用,某个基因或蛋白的缺失会由于其它基因或蛋白的存在而得到补偿,最终导致反应的净结果为零。由于细胞内的生命活动大多发生于代谢层面,代谢组学被认为是“组学”研究的最终方向。研究代谢组学分析的两种常用技术分别为核磁共振技术及质谱技术。

随后,赵老师介绍了国内开展了代谢组学研究的相关工作:军事医学科学院正在致力于建立600兆超导核磁共振、气相色谱-飞行时间质谱联机、液相色谱-串联质谱联机等代谢组学技术平台的工作;中国科学院大连化物所物理研究所于2004年10月和美国Waters公司合作组建“代谢组学联合实验室”,并于2005年7月,正式成立“代谢组学研究中心”,由许国旺研究员任主任、英国J.Nicholson教授和杨胜利院士任名誉主任。中国林业科学院林业研究所在“功能基因基因组和生物芯片”国家重大科技专项的资助下,开始了利用基因芯片和代谢组学技术研究丹参品质形成的分子机理的研究工作,试图通过整合转录组学和代谢组学分析所获得的数据来揭示丹参道地品质形成的原因。

最后,赵老师详细介绍了QTRAP用于糖尿病代谢组学研究初探的相关研究成果。研究探索的内容包括检测能力考查、扫描模式选择、日内/日间精密度并使用内标校正。研究表明:糖尿病前期患者血清代谢物变化:在接受生活方式干预的人群,pre-DM患者逆转为NG后,其血清代谢物变化主要与脂代谢有关,其中包括胆汁酸水平升高,甘油磷脂及甘油二酯水平下降。在接受生活方式干预的人群,pre-DM患者进展为DM后,其血清代谢物变化表现为胺类、丙酮酸、脂代谢相关产物(花生四烯酸、甘油一酯、鞘酯)、丙氨酸、肌酐、精氨酸代琥珀酸等水平升高。DM患者与NG组患者相比,胺类、肌酐、脂代谢相关产品物(甘油磷脂、甘油二酯、十四酰CoA、酰基肉毒碱、白三烯)、脱氧胆酸、缬氨酸、甘氨酸水平升高,而7a-羟胆固醇水平下降。

首都医科大学附属北京朝阳医院职业病与中毒医学科 李惠玲老师

来自首都医科大学附属北京朝阳医院职业病与中毒医学科的李惠玲老师作了题为《ICP-MS在血铅同位素测定中的应用》报告。主要介绍了血铅同位素检测的意义,铅同位素的应用,ICP-MS血铅同位素分析,应用举例四部分。

近年来铅中毒事件频发,血铅检测成为诊断儿童铅中毒的金标准,为了追溯导致血铅超标的“元凶”,利用铅同位素测定以评估铅的来源成为可选方法。铅污染源存在于空气、水、玩具和学习用品、中药材、土壤和尘埃、食品。因次,血铅同位素的检测具有重大意义。

铅有4种稳定同位素为204Pb、206Pb、207Pb、208Pb。铅同位素分析主要应用于考古:比较各个时代或时期青铜器样品的铅同位素数据,也可以了解不同时期、不同地区矿山开采利用的盛衰变迁;污染物来源:利用不同来源的物质中同位素丰度存在差异的原理,可检测环境与食品中污染物的来源;地质勘矿:利用铅同位素打靶法在成矿远景区内优选找矿靶区或在某一具体矿床中圈定矿体产出地段。

上世纪七十年代,美国最早开始铅同位素在血铅检测中的应用。其后在美国各州针对血铅溯源开展了很多工作,重点在油漆和汽油方面。近二十年,儿童铅中毒溯源工作在全球各地逐渐展开,规模也越做越大。已有部分国家做过了数千儿童的铅同位素溯源研究工作。溯源对象也扩大到矿石、餐具等。我国开展人体铅同位素溯源工作较晚,近十年才有少量研究工作报道。曾静、刘景秀等在2007年对北京和成都人群进行了铅同位素研究工作。

澳大利亚(1994)Gulson等在Broken Hill矿区测定了同一家庭中男性、女性和小孩的铅同位素组成,以确定他们血中的铅来源。成年女性一般血铅含量较低(<10ug/dl),主要来源不是城市周围的矿堆,而是几种铅源的混合,可能包括矿尘、汽油、食物和水。成人男性的血铅含量和同位素组成似乎与他们的职业和活动有关。小孩的血铅含量变化大,且与年龄有关。6至14岁的小孩具有与成人女性相似的血铅同位素组成;小于6岁的小孩血铅同位素组成与矿石中的成分更类似。美国(1998)阿拉斯加州疾控中心对2个城镇的20名成年女性进行了铅同位素测定以评估铅的来源。铅同位素组成在不同区域明显不同。铅的来源不是唯一的。在狩猎为主要活动和饮食方式的区域,铅弹是重要来源。

电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS是一种强有力的无机元素分析技术。通过此方法对云南和山西两地的儿童进行铅同位素溯源分析,结果表明:周围环境中各种可接触物质共同决定了人体血液铅同位素组成。不同地区间人体血液铅同位素组成可能会存在比较大的差异,同一地区间的差异会较小。要明确小区域范围内某一群体的铅同位素溯源,必须结合其他指标。

AB SCIEX公司的应用专家 潘峰云博士

来自AB SCIEX公司的应用专家潘峰云作了题为《LC-MS在临床检测分析中的应用进展》的报告。

潘工程师首先介绍了LC/MS/MS的八个特点: 1.LC/MS/MS拓展性强;2.多个化合物可同时测定,检测效率高;3.平均每个样品花费小,节约成本;4.可分别针对目标药物和代谢物,特异性强;5.速度快,几分钟内完成;6.灵敏度、准确度和精密度——假阳性低;7.新的检测项目容易开发方法;8..耐用性——仪器维护简单。LC-MSMS进入临床检测的新动力是对经济上的考量、样品分析的具体需求、添加新检测方法的能力等方面的因素。

随后,潘工程师对LC/MS/MS技术在新生儿筛查中的应用现状进行了介绍。

新生儿筛查是对一些目前还无法在产前做出诊断的先天性疾病在新生儿进行普查,以筛选出病人,提前做出诊断,提前进行治疗。先天性疾病中大部分属于先天性遗传代谢疾病,目前已经知道的不下上百种。这些疾病多数不致死,但可以严重影响患儿的智力和体格,造成痴呆等疾病和残缺以及畸形等,给家庭,社会,国家带来沉重的负担。直到1963年,美国医学家罗伯特发明了细菌抑制法进行标本采集,才给新生儿筛查工作的开展打开了新的局面,如今世界上已经有几十个国家开展了新生儿筛查工作。通常的化验方法是采血和采尿。但操作复杂,采血量多,家长难以承受,不宜大规模展开,现在只要一滴血就可以进行新生儿筛查,筛查出来的婴儿可以在几天内进行诊断和治疗。孩子可以完全避免损害,正常生长发育。

美国目前每年约对400万新生儿进行筛查,多数州筛查包括PKU在内的8种疾病,而有些州则要求35种以上疾病的筛查。筛查的范围:氨基酸代谢、有机酸代谢、脂肪酸代谢、血红蛋白途径。

最后,潘工程师对LC/MS/MS技术在治疗药物监测中的应用现状进行了阐述。临床治疗药物监测TDM分为免疫抑制药物、逆转录病毒药物。国内外主要的TDM检测方法包括:光谱法、免疫分析法、HPLC/UV高效液相/紫外检测、LC/MS/MS法。在临床研究中,由于个人体内代谢变化以及代谢酶的差异性,药物对代谢酶的诱发性,蛋白酶抑制剂PI和非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)抗逆转录病毒药物的监测具有重大的意义。潘工程师以维生素D、类固醇、微量睾酮的分析实验进行了举例说明。


质谱沙龙2012年报告交流会合影


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